Reunión de Neurociencias: Glutamate regulates actin–based motility in axonal filopodia

Este es un resumen de la reunión del jueves de la semana pasada. El artículo fue algo denso pero tenía cosas muy interesantes, especialmente en cuanto a sinaptogénesis se refiere. La sección de métodos era muy elaborada y si quisiéramos hacer una crítica concienzuda tendríamos que conocer todos los métodos empleados, muchos de los cuales eran muy complicados y nuevos para nosotros, de todas maneras se comprendieron varias cosas sobre el tema y se realizaron algunas preguntas interesantes. Hablamos principalmente de las acciones reguladoras que ejerce el glutamato sobre receptores AMPA/kainato y NMDA sobre las filopodias que nacen del eje del axón (que sugieren estar comprometidas con la navegación del axón) y la de la punta del axón (que sugieren estar comprometidas con la sinpatogénesis). Un mejor entendimiento de estos mecanismos reguladores, así como de los factores de crecimiento involucrados en crecimiento de dendritas, nos podrá ayudar a comprender la LTP (long term potentiation) de una manera más completa. En teoría, se sabe que el receptor AMPA es estimulado para mantener la morfología de las espinas y el receptor NMDA es estimulado para la formación de novo de espinas.

Sobre el artículo, muchos de los resultados están documentados de una manera extraordinaria mediante imágenes de alta resolución tomadas cuadro por cuadro con microcámaras que muestran el movimiento de una filopodia en un periodo de tiempo. Se usaron para este experimento neuronas transfectadas de hipocampo de rata en estado embrionario que fueron trabajadas in vivo. Para demostrar la gran motilidad de las filopodias se marcaron las neuronas con GFP (green fluorescent protein). Se grabó la motilidad de estas neuronas en el tiempo mediante time-lapse recording, y se visualizó usando un programa especial: Metamorph Software, que además trabajaba las imágenes pixel por pixel para mostrarlas como fuera necesario (en blanco y negro, escala de grises o a colores dependiendo del experimento).

Lo que se visualiza en la imagen en la parte superior de este párrafo en verde es el axón y las dendritas marcadas con la GFP, lo que se ve de color naranja es un marcador tau específico para axón; el color verde demuesta la gran cantidad de actina de las filopodias. El uso de glutamato en los cultivos causó un decremento del movimiento de las filopodias como se puede observar en la imagen de la parte inferior. Luego de retirado el glutamato (washout) se revierte el efecto. Así, en la imagen superior de este párrafo se visualiza a todas las filopodias en movimiento, en la imagen inferior se visualiza como el glutamato inhibe esta activa motilidad. Si se preguntan como es que se mide este índice de motilidad, es mediante un cálculo matemático a partir de un ratio donde el numerador es la diferencia entre el espacio acumulativo que ocupa la filopodia y el espacio en el que se mueve durante el tiempo. El denominador es la zona total.

Para investigar que receptores que regulan estas funciones se procedió de la siguiente manera: NMDA: con niveles de magnesio reducidos a 0.1 mM. AMPA: bloqueados con 100 uM CNQX . Para eliminar toxicidad mediada por NMDA se usó APV, un inhibidor de NMDA (en todos los cultivos). Se demostró que AMPA tuvo un efecto inhibidor fuerte sólo bloqueado por CNQX (antagonista no específico de AMPA/kainato). Para bloquear solo AMPA se usó GYKI 52466 (antagonista específico), de este manera se puede difernciar las particularidades del AMPA y el kainato por separado. En ausencia de calcio ninguno de estos receptores inhibió el movimiento de las filopodias (sugiere que el proceso es dependiente del ión). Los resultados del uso de AMPA se muestran en la figura de la derecha, donde las manchas negras en la figura que dice motility son los conglomerados de actina contrayéndose activamente (esto se consigue con el software especial que repixelea las imágenes captadas en escalas de grises). Como pueden observar cuando se usa el AMPA la motilidad desparece por completo, lo que se reafirma con la ausencia de puntos negros en el cuadro más inferior.

Otra cosa que se comprobó fue si el glutamato inhibe o no las funciones de reciclaje de vesículas sinápticas o influye de alguna manera en la endocitosis o exocitosis. Para esto se basaron en la siguiente hipótesis: si la acción del glutamato cumple un rol fisiológico en la formación sináptica, el tráfico de vesículas y reciclaje de las mismas no se debería ver alterado (esto es, debería presentarse una endo y exocitosis normal de vesículas en los terminales sinápticos). Cultivos con anticuerpos conjugados con Cy3 dirigidos contra el dominio lumenal de synaptotagmina I mostró fluorescencia en las filopodias. (el Cy3 es tomado activamente por las vesículas sinápticas y la sinaptotagmina es un sensor de baja afinidad de calcio). Como los anticuerpos fueron tomados selectivamente por las vesículas durante la endocitosis, se demostró que en presencia de glutamato no había diferencia con los controles. Los resultados de este experimento se muestran en la parte inferior de este párrafo, donde se pueden ver en escala de grises las zonas de fluoresencia del anticuerpo marcado.

Se investigó si los mecanismos regulatorios de la plasticidad y sinaptogénesis actuaban o no de manera local. Se tomó una filopodia a la cual se le perfundió glutamato con un flujo local, para esto se usaron dos micropipetas a una distancia determinada de la filopodia donde se perfunde (elegantemente) glutamato con un flujo permanente puesto que una de las pipetas ejerce presión negativa (succiona) y otra hace presión positiva (perfunde). Con esta perfusión uds pueden observar que solo la filopodia afectada cambia su motilidad y las demás no. Esto demuestra la acción local del glutamato respecto de las filopodias. De no ser así las demás también hubieran disminuido su motilidad por señalización celular. Si se fijan en la flecha notarán que solo la filopodia perfundida es la afectada.

Una pregunta que valdría la pena hacerse y que sería muy interesante de responder es de donde sale este glutamato en el cerebro humano, y cuales son los mecanismos mediante el cual se estimula esta liberación, de esta manera se podría entender de una mejor manera las cuestiones involucradas en la potenciación a largo plazo.